Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

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Forschungsschwerpunkte Molecular Modelling

Übersicht

* Rationales Design von selektiven Anionen-Rezeptoren
* Theoretische Untersuchungen zur Struktur und Funktion molekularer Kapseln und selbst-organisierter Überstrukturen basierend auf Calixarenuntereinheiten
* Struktur-Wirkungs-Analysen an Substraten des humanen Peptidtransporters PEPT1
* Referenzen

Rationales Design von selektiven Anionen-Rezeptoren

Im Gegensatz zu den hochentwickelten künstlichen Rezeptoren für Kationen ist das Problem der starken und selektiven Anionen-Erkennung ungeachtet kürzlich erzielter Fortschritte noch immer nicht gelöst. [1] Eine der größten Herausforderungen ist die Entwicklung von Rezeptoren, die selektiv anorganische Oxyanionen, wie Nitrat, Sulfat und Phosphat komplexieren können. Diese Anionen sind wichtige Targets im industriellen, Umwelt- und Gesundheitsbereich. Eine Strategie für das Design solcher Anionen-Rezeptoren ist die Anknüpfung von H-Brücken-Donoren an ein mehr oder weniger rigides Molekülgerüst. Da Wasserstoffbrücken gerichtet sind, sollte es somit möglich sein, formselektive Rezeptoren zu entwickeln, die zwischen Anionen mit unterschiedlicher Geometrie differenzieren können.

Abb. 1: Beispiele für Anionenrezeptormoleküle

Abb. 1: Beispiele für Anionenrezeptormoleküle

Abb. 1: Beispiele für Anionenrezeptormoleküle

Harnstoff-Funktionen (R-NH-CO-NH-R) sind wegen ihrer Fähigkeit zur Ausbildung von H-Brücken häufig als Bindungsstellen in Anionenrezeptoren eingesetzt worden. Verschiedene Tri- und Tetraharnstoff-Derivate vom Podand-Typ sind beschrieben worden, die (sphärische) Anionen wie Halogenide komplexieren. Eine bessere Präorganisation dieser Bindungsstellen sollte durch ihren Einbau in ein makrocyclisches Gerüst erreichbar sein. Überraschenderweise sind bisher jedoch nur drei Beispiele makrocyclischer Harnstoffderivate (1-3) als Anionenrezeptoren getestet worden. [2, 3, 4] Ihre Komplexierungseigenschaften sind eher moderat, vermutlich wegen der hohen konformativen Flexibilität der Liganden oder einer mangelhaften Passform.

Durch eine strikt C3-symmetrische Anordnung der Harnstoffeinheiten in einem makrocyclischen Triharnstoff sollte es möglich sein, insbesondere planare und tripodale Anionen wie NO3-, R-SO3-, R-PO32- oder CO32- zu adressieren. Eine korrekte räumliche Anordnung des Rezeptors sollte es dann gestatten, diese Anionen voneinander bzw. von sphärischen Anionen zu unterscheiden.

Dieser allgemeinen Idee folgend, haben wir verschiedene C3-symmetrische Makrocyclen entworfen und ihre Affinität gegenüber den erwähnten Anionen mit Hilfe von MD- und FEP-Simulationen untersucht. Rezeptoren des allgemeinen Typs 4, die aus Xanthen-Einheiten bestehen, die in 4,5-Position über (Thio)Harnstoff-Funktionen verknüpft sind, besitzen demnach die geeignete Orientierung der Bindungsstellen. MD-Simulationen sagen eine starke Bindung von Nitrat über sechs NH...O-Wasserstoffbrücken voraus. Die Affinität von 4 (Y = O) gegenüber den tripodalen Anionen R-SO3- (Abb. 2) und R-PO32- scheint jedoch noch größer zu sein.

Abb. 2: Anionenrezeptor mit komplexiertem Anion

Abb. 2: Anionenrezeptor mit komplexiertem Anion

Abb. 2: Anionenrezeptor mit komplexiertem Anion

Gegenwärtig werden erste Verbindungen des Typs 4 synthetisiert, die dann auf ihre Komplexierungseigenschaften gegenüber den erwähnten Anionen getestet werden sollen. Ausgehend von diesen experimentellen Ergebnissen werden sich wiederum theoretische Untersuchungen zur Lösungstruktur und Präorganisation der Anionophoren sowie zum Komplexierungsmechanismus nötig sein, mit dem Ziel, detaillierte Informationen über die molekulare Erkennung von Anionen zu erhalten und ein "fine-tuning" der Selektivitäten über strukturelle Modifikationen der Rezeptoren zu erreichen. Da Molecular Modelling Untersuchungen über die Anionen-Komplexierung durch Makrocyclen nur selten publiziert worden sind,[5, 6] erhoffen wir uns nicht zuletzt eine Validierung der verwendeten theoretischen Modelle.

Theoretische Untersuchungen zur Struktur und Funktion molekularer Kapseln und selbst-organisierter Überstrukturen basierend auf Calixarenuntereinheiten

Moleküle mit konkaven Oberflächen, die durch einen Satz von (selbst-) komplementären Wasserstoffbrücken-Donor- und Akzeptorfunktionen gesäumt sind, besitzen nicht nur die Fähigkeit zum definierten dreidimensionalen Aufbau dimerer (oder tetramerer [7]) Assoziate, sie umschließen gleichzeitig einen inneren Hohlraum, der zur Aufnahme geeigneter Gastmoleküle befähigt ist.[8,9] Als Beispiele für derartige konkave Grundbausteine seien hier vor allem funktionalisierte Glycolurile, die zu "Sportbällen" unterschiedlichster Art (Tennis-, Soft-, Baseball) assoziieren, sowie Makrocyclen vom [14]-Metacyclophantyp (Calix[4]arene, Resorc[4]arene) genannt.

Diese molekularen Kapseln umschließen wie die Carceranden[10] den Gast vollständig; im Gegensatz zu diesen erfolgt der Einschluß jedoch nicht permanent, sondern auf einer Zeitskala, die von Sekundenbruchteilen[11] bis hin zu etlichen Stunden[12] (ja Monaten[13]) reicht. Eine solche Kombination von Stabilität und Reversibilität läßt die nichtkovalent verknüpften Kapseln für verschiedene Anwendungsgebiete interessant erscheinen, wie z.B. zur Verwendung als "Reaktionsgefäße", für den Transport bioaktiver Stoffe durch Membranen oder zur Herstellung neuer Materialien.

Die Dimerisierung von Calix[4]arenen, die am weiteren Rand durch Harnstoffeinheiten substituiert sind, ist inzwischen etabliert.[14] In den S8-symmetrischen Kapseln 5/Gast/5 verzahnen sich die selbst-komplementären Harnstoffsubstituenten und es entsteht ein cyclisches System von 16 intermolekularen Wasserstoffbrücken in Kopf-Schwanz-Anordnung (Abb. 3). Für die Dimerisierung ist die Anwesenheit eines geeigneten Gastes unbedingt erforderlich.

Abb. 3: a) Dimerisierung von Tetraureidocalix[4]arenen, b) das System von Wasserstoffbrücken in dimeren Tetraureidocalix[4]arenen, dargestellt in Richtung der Moleküllängsachse.

Abb. 3: a) Dimerisierung von Tetraureidocalix[4]arenen, b) das System von Wasserstoffbrücken in dimeren Tetraureidocalix[4]arenen, dargestellt in Richtung der Moleküllängsachse.

Abb. 3: a) Dimerisierung von Tetraureidocalix[4]arenen, b) das System von Wasserstoffbrücken in dimeren Tetraureidocalix[4]arenen, dargestellt in Richtung der Moleküllängsachse.

Ungeachtet der zahlreichen Beispiele, die inzwischen synthetisch realisiert wurden, konnte die Struktur eines solchen Dimers bislang nur für ein einziges Beispiel[15] mit Hilfe einer Röntgenkristallstrukturanalyse nachgewiesen werden. Strukturelle Informationen lassen sich m.E. aus ihren 1H-NMR Spektren ableiten, für detaillierte Untersuchungen ihrer Form und Größe muß jedoch auf theoretische Untersuchungen zurückgegriffen werden. substituenten So konnten wir eine befriedigende Erklärung dafür finden, warum Homodimere des Tritylphenylharnstoff-Derivats 5b Toluen oder Benzen als Gast einschließen, die kleineren Heterodimere von 5a und 5b jedoch nur in Benzen gebildet werden.[16] Der Hohlraum der Homodimere von 5a sollte aufgrund der mechanischen Verhakung der Harnstoff-Substituenten noch kleinere Ausmaße besitzen, was in Übereinstimmung mit der Tatsache ist, daß ihre Bildung nur noch durch Tetramethylammonium als Gast erzwungen werden kann.[17] Derartige Kapseln (5a/Me4N+/5a) sind selbst in DMSO kinetisch stabil. Der schnelle Richtungswechsel des Wasserstoffbrücken-Gürtels bei Einschluß kationischer Gäste, dessen Geschwindigkeit höher ist als die Geschwindigkeit der Dissoziation/Rekombination der Kapsel, läßt sich anhand von MD-Simulationen durch die Schwächung des intermolekularen Systems von H-Brücken befriedigend erklären.[18] Die vorausgesagte Struktur der Kapsel mit eingeschlossenem Tetraethylammonium-Kation wurde durch die vor kurzem gelöste Kristallstruktur eindrucksvoll bestätigt.[19]

schema4 molmod

schema4 molmod

Eine Vielzahl grundlegender Problemstellungen, wie der Mechanismus von Dissoziation/Rekombination, die manchmal ausschließliche Bildung von Homo- bzw. Heterodimeren, die nicht zu beobachtende Bildung von Kapseln aus Pentaharnstoff-Calix[5]arenen (für die MD-Simulationen eine ähnliche thermodynamische Stabilität voraussagen wie für die entsprechenden Kapseln aus Calix[4]arenen) bedarf in Zukunft noch der Klärung.

Die Zielstellung dieser Arbeiten ist letztendlich das Verständnis der Selbstorganisation von Molekülen und der zugrundeliegenden (nichtkovalenten) Kräfte. Auf diese Art und Weise können Voraussagen aus theoretischen Untersuchungen zum (rationalen) Design hochgeordneter supramolekularer Systeme beitragen.

Struktur-Wirkungs-Analysen an Substraten des humanen Peptidtransporters PEPT1

Peptide gewinnen in Verbindung mit Strukturmodifikationen zur Erhöhung ihrer enzymatischen Abbaustabilität eine zunehmende Bedeutung als Leitstrukturen für die Entwicklung von Peptidpharmaka/Peptidmimetika. Unser Ziel ist letztlich die Verbesserung ihrer Bioverfügbarkeit und die Entwicklung neuer oral verfügbarer Pharmaka. Für die Erhöhung der Bioverfügbarkeit ist die Ausnutzung existierender Transportsysteme aus physiologischer und biotechnologischer Sicht die erfolgversprechendste Strategie. Voraussetzung dafür sind Untersuchungen zu Struktur-Wirkungs-Beziehungen an Modellpeptiden.

Unter physiologischen Bedingungen transportieren die Epithelzellen von Darm und Niere Di- und Tripeptide aktiv durch die luminale Membran.[20] Dieser Transport wird durch tertiär-aktive H+/Peptid-Symporter realisiert. Die Carrier sind elektrogen und werden durch einen nach innen gerichteten Protonengradienten stimuliert. Während das Darmepithel nur über einen Peptidtransporter (PEPT1) verfügt, existieren in den Epithelzellen des Nierentubulus sowohl der nierenspezifische Peptidtransporter (PEPT2) als auch der intestinale PEPT1-Typ. PEPT1 ist ein Transporter von niedriger Affinität, aber hoher Kapazität. Dagegen besitzt PEPT2 eine 20fach höhere Affinität zu vergleichbaren Peptiden. Hinsichtlich der unterschiedlichen Substratspezifität beider Carrier gibt es nur wenige Untersuchungen. Allgemein scheint sich der molekulare Unterschied zwischen PEPT1 und PEPT2 mehr in der Affinität und weniger in der Selektivität widerzuspiegeln.

Von pharmakologisch besonderem Interesse ist, daß Peptidtransporter aus Gründen der Strukturähnlichkeit ß-Lactam-Antibiotika, insbesondere Cephalosporine, aber auch Penicilline transportieren. Das ermöglicht die orale Applikation von Medikamenten, die auf diesen Grundstrukturen basieren. Die H+/Peptid-Symporter akzeptieren außerdem Bestatin und Angiotensin-Converting-Enzyme (ACE)-Inhibitoren. Die Nutzung des intestinalen Peptidtransporters für den Transport von Prodrugs wurde kürzlich mit Valacylovir beschrieben.[21]

Die dreidimensionale Struktur der Peptidtransporter ist noch unbekannt und wird auch in naher Zukunft nicht verfügbar sein. Solange diese Situation besteht, basieren die Hypothesen über die Struktur der Bindungstasche auf zwei Arten von Experimenten, der funktionalen Analyse von chimären Säugetier-Peptidtransportern und Molecular Modelling-Studien ausgehend von Informationen über die Substrat-Affinität. Derzeit sind die Affinitäten von ca. 400 Substraten bekannt, die erstmals am gleichen Modell (Caco-2 Zellen) erhalten wurden. Damit liegen genügend experimentelle Daten vor, um mittels computergestützter Analysen die essentiellen Strukturanforderungen zu ermitteln. Bisherige Ansätze konzentrierten sich auf strukturell rigide Verbindungen[22] oder sind generell in Frage zu stellen,[23] da das verwendete Datenmaterial (IC50-Werte) aus unterschiedlichen Modellen stammt und nicht abstrahiert werden kann. Hinzu kommen ständig neue Erkenntnisse bezüglich der Substratstruktur.

Unsere bisher durchgeführten Untersuchungen zur Substratspezifität von PEPT1 basieren auf drei Strategien: der "active analog approach" (AAA), dem Vergleich mit der bioaktiven Konformation von Substraten bakterieller Peptid-Transporter[24] und der dreidimensionalen Struktur-Wirkungsanalyse (3D-QSAR). Mit Hilfe der beiden ersteren Strategien konnten wir ausgehend von der Konformationsanalyse einer Vielzahl von Dipeptiden, Dipeptid-Derivaten und ß-Lactamantibiotika eine Pharmakophor-Hypothese (Abb. 5) entwickeln, die die Basis für CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis) und CoMSIA (Comparative Molecular Similarity Indices Analysis) Studien bildete. Die statistisch signifikanten CoMFA- und CoMSIA-Modelle (belegt durch hohe q2-Werte) ermöglichen nun Aussagen zur Substratspezifität von PEPT1. Insbesondere mit Hilfe der CoMSIA-Methode konnten Bereiche der Substratstruktur (gekennzeichnet durch spezifische sterische, elektrostatische, lipophile und H-Brückenbindungs-Eigenschaften) identifiziert werden, die für die Unterschiede in der Selektivität verantwortlich sind.

Abb. 5: Alignment der vorgeschlagenen bioaktiven Konformationen eines Trainingssatzes von 78 Dipeptiden, Dipeptid-Derivaten und ß-Lactamantibiotika

Abb. 5: Alignment der vorgeschlagenen bioaktiven Konformationen eines Trainingssatzes von 78 Dipeptiden, Dipeptid-Derivaten und ß-Lactamantibiotika

Zukünftige Arbeiten werden sich zunächst darauf konzentrieren, neue Substrate (und Inhibitoren) zu entwickeln und ihre Affinität vorherzusagen. Durch ein enges Wechselspiel mit experimentellen Arbeiten (Synthese und Testung) soll das vorliegende Modell schließlich verfeinert und zum Design von Prodrugs genutzt werden. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Entwicklung eines Modells der Bindungstasche des Proteins PEPT1. Hiervon versprechen wir uns weitere Hinweise auf die Bindungsspezifität (eventuell auch unter Berücksichtigung des umgebenden Mediums) sowie quantifizierende Aussagen über die Bindungskonstanten der Substrate mit Hilfe von FEP-Simulationen.

Referenzen

  1. Zu einer kürzlich erschienenen Übersicht über Anionenrezeptoren vgl. Beer, P. D., Gale, P. A., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 40, 486.
  2. Alcazar, V., Segura, M., Prados, P., de Mendoza, J., Tetrahedron Lett. 1998, 39, 1033.
  3. Snellink-Ruel, B. H. M., Antonisse, M. M. G., Engbersen, J. F. J., Timmerman, P., Reinhoudt, D. N., Eur. J. Org. Chem. 2000, 165.
  4. N.N.
  5. Lee, K. H., Hong, J.-I. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 6083.
  6. Wiorkiewicz-Kuczera, J., Bowman-James, K. in Supramolecular Chemistry of Anions, Eds. Bianchi, A., Bowman-James, K. Garcia-Espana, E., Wiley-VCH, New York, 1997, 335.
  7. Jost, P., Schurhammer, R., Wipff, G., Chem. Eur. J. 2000, 6, 4257.
  8. Nuckolls, C., Hof, F., Martin, T., Rebek Jr., J. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 10281. Hof, F., Nuckolls, C., Rebek Jr., J. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 4251.
  9. Zu Übersichten vgl. z. B. Rebek Jr., J. Chem. Soc. Rev., 1996, 255. Rebek Jr., J. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 278. Chapman, R. G., Sherman, J. C. Tetrahedron 1997, 53, 15911-15945. de Mendoza, J. Chem.-Eur. J., 1998, 4, 1273.
  10. Vgl. auch: Struck, O., Verboom, W., Smeets, W. J. J., Spek, A. L., Reinhoudt, D. N. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1997, 223. MacGillivray, L. R., Atwood, J. L. Nature (London) 1997, 389, 469. Timmerman, P., Vreekamp, R. H., Hulst, R., Verboom, W., Reinhoudt, D. N., Rissanen, K., Udachin, K. A., Ripmeester, J. Chem.-Eur. J. 1997, 3, 1823. Higler, I., Verboom, W., Van Veggel, F. C. J. M., De Jong, F., Reinhoudt, D. N. Liebigs Ann./Recl. 1997, 1577. Chapman, R. G., Sherman, J. C. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 9818. Heinz, T., Rudkevich, D. M., Rebek Jr., J. Nature, 1998, 394, 764. Higler, I., Grave, L., Breuning, E., Verboom, W., De Jong, F., Fyles, T. M., Reinhoudt, D. N. Eur. J. Org. Chem. 2000, 1727. Kobayashi, K., Shirasaka, T., Yamaguchi, K., Sakamoto, S., Horn, E., Furukawa, N. Chem. Commun. 2000, 41.
  11. Cram, D. J., Cram, J. M. Container Molecules and their Guests, Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1994, S. 131-216. Jasat, A., Sherman, J. C. Chem. Rev. 1999, 99, 931. Conn, M. M., Rebek Jr., J. Chem. Rev. 1997, 97, 1647.
  12. Mogck, O., Pons, M., Böhmer, V., Vogt, W. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 5706.
  13. Vysotsky, M. O., Thondorf, I., Böhmer, V. Angew. Chem. 2000, 39, 1264.
  14. Vysotsky, M. O., Böhmer, V. Org. Lett., 2000, 2, 3571.
  15. Rebek Jr., J. Chem. Commun. 2000, 637.
  16. Mogck, O., Paulus, E. F., Böhmer, V., Thondorf, I., Vogt, W. Chem. Commun. 1996, 2533.
  17. Vysotsky, M. O., Thondorf, I., Böhmer, V. Angew. Chem. 2000, 112, 1309, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 2000, 39, 1264.
  18. Vysotsky, M. O., Thondorf, I., Böhmer, V. Chem. Commun., 2001, 1890.
  19. Vysotsky, M. O., Pop, A., Broda, F., Thondorf, I., Böhmer, V. Chem. Eur. J. 2001, 7, 4403.
  20. Thondorf, I., Broda, F., Rissanen, K., Vysotski, M. O., Böhmer, V., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 2002, 1796.
  21. Daniel, H. J. Membr. Biol. 1996, 154, 197. Adibi, S. A. Gastroenterology 1997, 113, 332.
  22. Balimane, P. V., Tamai, I., Guo, A., Nakanishi, T., Kitada, H., Leibach, F. H., Tsuji, A., Sinko, P. J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 250, 246.
  23. Bolger, M. B., Haworth, I. S., Yeaung, A. K., Ann, D., von Grafenstein, H., Hamm-Alvarez, S., Okamoto, C. T., Kim, K.-J., Basu, S. K., Wu, S., Lee, V. H. L. J. Pharm. Sci. 1998, 87, 1286. Swaan, P. W., Koops, B. C., Moret, E. E., Tukker, J. J. Receptors and Channels 1998, 6, 189.
  24. Bailey, P. D., Boyd, C. A. R., Bronk, J. R., Collier, I. D., Meredith, D., Morgen, K. M., Temple, C. S. Angew. Chem. 2000, 112, 516.

Man vermutet, daß die Substrate beider Transportsysteme ähnliche Erkennungskonformationen besitzen: Marshall, N. J., Grail, B. M., Payne, J. W. J. Pept. Sci. 2001, 7, 175.

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